ISBN 9783843902960

978-3-8439-0296-0, Reihe Biologie

Sophie Winterfeld
In vitro Interaktionsstudie der bakteriellen Insertase YidC von Escherichia coli mit seinem Substrat Pf3 coat Protein durch Fluoreszenzspektroskopie

125 Seiten, Dissertation Universität Hohenheim Stuttgart-Hohenheim (2011), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Die bakterielle Insertase YidC von Escherichia coli spielt eine essentielle Rolle bei der Insertion diverser Proteine, sowohl im Komplex mit der Sec-Translokase als auch als eigenständiges Protein (YidC-only). Das am besten untersuchte Substrat des YidC-only Weges ist das Haupthüllprotein des filamentösen Phagen Pf3, Pf3 coat. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Insertionsprozess von Pf3 coat in YidC- Proteoliposomen in vitro mit Hilfe von fluoreszenzspektroskopischen Methoden untersucht. Neben der Charakterisierung der Bindung von Pf3 coat an YidC durch Fluoreszenz-Titrationsmessungen, konnte mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie der Mechanismus des Insertionsprozesses näher untersucht werden. Durch Verwendung von Einzel-Cystein Mutanten sowohl von YidC als auch Pf3 coat wurden spezifisch fluoreszenzmarkierte Proteine für diese Interaktionsstudie eingesetzt. Die Funktionalität der verwendeten Einzel-Cystein Mutanten von YidC konnte durch einen Komplementationstest gezeigt werden.

Sowohl die YidC- als auch die Pf3 coat Mutanten wurden erfolgreich gereinigt und fluoreszenzmarkiert. YidC wurde in Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung rekonstituiert und die Topologie biochemisch nachgewiesen. Das beste Ergebnis wurde dabei mit 100% DOPC-Liposomen erhalten. Mittels Fluoreszenz- Titrationsmessungen wurde zunächst die Bindung von Pf3 coat an YidC- Proteoliposomen durch Bestimmung der Dissoziationskonstante KD charakterisiert. Für die Einzel-Cystein Mutanten von YidC wurden dem WT entsprechende KD-Werte von ca. 1 μM erhalten. Damit konnten frühere Messungen mit solubilisiertem YidC bestätigt werden.